M-MuLV Reverse Transkriptase

M-MuLV-Reverse Transkriptase mit reduzierter RNase H-Aktivität (RNase H–). Das Enzym, das ausgehend von einem Primer einen komplementären DNA-Strang synthetisiert und dabei entweder RNA (cDNA-Synthese) oder einzelsträngige DNA als Vorlage verwendet.

M-MuLV Reverse Transkriptase

M-MuLV-Reverse Transkriptase

Anwendungen:
- RT PCR
- Synthese von cDNA
- mRNA 5'-Ende-Mapping durch Primer-Extension-Analyse
- Endmarkierung von DNA
- Didesoxynukleotid-Sequenzierung

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Anwendungen:
- RT PCR
- Synthese von cDNA
- mRNA 5'-Ende-Mapping durch Primer-Extension-Analyse
- Endmarkierung von DNA
- Didesoxynukleotid-Sequenzierung

Nutzen:

- Die konstruierte M-MLV RT bleibt bis zu 50 °C aktiv und erhöht so
die Länge und Ausbeute der cDNA im Vergleich zur WT-Version.

- Kann cDNA in Reaktionen mit weniger als 100 pg RNA-Vorlage
effizient erkennen und produzieren.

- Amplifickation bis zu 8kb.

- reduzierte RNase H-Aktivität (RNase H–) als der Wildtyp M-MLV
RT.

Beschreibung:
M-MuLV Reverse Transkriptase, kodiert durch das Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV RT), ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die den ersten Strang der cDNA aus einer einzelsträngigen RNA-Vorlage synthetisiert, an die ein Primer hybridisiert wurde. M-MuLV RT verlängert auch Primer, die an einzelsträngige DNA hybridisiert sind. Die Synthese des zweiten Strangs der cDNA kann aus einigen mRNA-Vorlagen ohne zusätzliche DNA-Polymerase erreicht werden.

Konzentration: 200 u/µl

Speicherpuffer:
20 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 % Glycerin, 0,1 % IGEPAL, 1 mM DTT.

Reaktionspuffer komplett 10X: 50,0 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25 °C); 3,0 mM MgCl ₂ ; 75,0 mM KCl; 10,0 mM DTT .

Verdünnungspuffer 1X :

10 mM KH 2 PO 4 (pH 7,5); 0,1 mM EDTA; 200 mM NaCl; 7 mM 2-Mercaptoethanol; 50 % Glycerin

Einheitendefinition:
Eine Einheit des Enzyms baut 1 nmol dTTP in 10 Minuten bei 37 °C in säurefällbares Material ein, wobei Poly(A)-Oligo-dT als Matrizenprimer verwendet wird.

Transport: auf blauem Eis

Lagerung: bei -20°C für 24 Monate

Notes: RT Enzym / MMLV RTase / RNA Template / Complementary DNA / cDNA / Reverse Transkription / Molecular cloning / RNA Sequenzierung / PCR / Genomanalyse / superscript

Anwendung:

Standardprotokoll: Wir empfehlen die Herstellung von 2 Mischungen

Mischung I

Komponente	Menge/Konz.
a. Gesamt-RNA oder b. PolyA-RNA c. Strangspezifischer Primer oder d. Oligo-dT/Random-Primer für jedes µg RNA	1–5 µg 50–500 ng 10 pM 250–500 ng
steriles Wasser	bis zu 8 µl
Inkubation	Temperatur
10 Minuten	70 °C
10 - 15 min (für c.- spezifische Primer) oder 5 min (für d.- Oligo-dT/Zufallsprimer)	Zimmertemperatur, auf Eis legen

Mischung II

Komponente	Menge/Konz.
10X Reaktionspuffer	2 µl
dNTP-Mischung (je 10 mM = 40 mM)	1 µl
optional: RNAsin	20-40 Einheiten
MMLV Reverase (200 U/µl)	200 Einheiten
steriles Wasser	bis zu 20 µl
Mix I und Mix II mischen und vorsichtig vormixen

Schritt	Temperatur
30 - 115 min ^1.)	37 - 55°C ^2.)
10 min (Inaktivierung des Enzyms)	65-70°C

^1.) 30 min für cDNA mit 500 bp; 115 min für 1,5 kb
^2.) hängt von der RNA ab: Höhere Temperaturen (bis 55 °C) für höher strukturierte RNA; Versuchen Sie, den pH-Wert auf 8,8 einzustellen

Hinweis: MMLV eignet sich unter Standardreaktionsbedingungen bei 37 °C am besten für die Synthese von 8 kb oder weniger.

Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 42 °C kann eine Synthese von bis zu 10 kb ermöglichen. Die MMLV-Aktivität sinkt über 42 °C drastisch.

Stability tests / Quality control / Comparison

Quality control:
Endonuclease Activity: 1 µg of Type 1 supercoiled plasmid DNA is incubated with 500 units of enzyme in 1X reaction buffer for one hour at 37°C. The supercoiled DNA is visualized on an ethidium bromide-stained agarose gel to verify absence of nicking or cutting.

Nuclease Activity: 50 ng of radio labelled DNA or RNA is incubated with 200 units of enzyme in 1X reaction buffer for one hour at 37°C, resulting in <1% release for both DNase and RNase.

Purity: >90% as judged by SDS-polyacrylamide gels with blue staining. MMLV RT is free of detectable RNase, and DNase (exo- and endonuclease) activities.

English description:

M-MuLV

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Deutsche Beschreibung

Datasheet M-MuLV Reverse Transcriptase

MMLV Reverse Transcriptase

The enzyme that synthesizes a complementary DNA strand initiating from a primer using either RNA (cDNA synthesis) or single stranded DNA as a template

MMLV REverse Transcriptase 10.000 units.

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References / Protocols / Notes / Recomendations / Tests

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